小鼠IL-18定量分析酶联免疫

检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-1O浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系EBET易博。

IL-18简介：

白介18（IL-18）是一个18 kDa的细胞因子，结构上与IL-1极其相似，对T细胞的活化有重要影响。IL-18的前体缺少信号肽，前体由IL-1beta转换酶（ICE）裂解为成熟的IL-18。

有报道称IL-18由下列细胞产生：树突状细胞、活化的巨噬细胞、凯夫勒细胞、角化细胞、肠内皮细胞、格根包尔氏细胞、肾上腺皮质细胞等。其中有报道称人的角化细胞是IL-18的主要产生源。

IL-18对T辅助细胞起作用，其效果是与IL-12协同强烈刺激T辅助细胞产生IFN-γ。当然，IL-18也有许多其它的效用，包括刺激外周血中由单核细胞产生IFN-γ 和 GM-CSF水平的升高，刺激T细胞产生Th1类的细胞因子如IL-2、IFN-γ 和GM-CSF等，提高Th1类的细胞表面的Fas配体的表达。此外，在治疗肿瘤、感染和自身免疫方面，IL-18也是一个重要的预后指标。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-18的浓度。IL-18捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-18会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IL-18抗体后，抗小鼠IL-18抗体与小鼠IL-18接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在小鼠IL-18蛋白将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，小鼠IL-18浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中小鼠IL-18浓度。

小鼠IL-18定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，

D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注:样本如需稀释请用标准品稀释液稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

样本的稀释:

1. 血清或血浆样本5~30倍稀释，不同样本含量不一样，检测前需预实验，如无明确范围，可从5倍开始。

2.细胞上清及尿样本稀释倍数根据预实验确定；

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.将5×标准品稀释液用去离子水或双蒸水按1:4稀释成所需的体积；

4.将检测抗体用检测抗体稀释液按标识提前10分钟配制成工作浓度；

5.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-18终浓度达到1500pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为100ng/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）下图为标准品稀释示意图。

洗涤方法:

自动洗板机或小鼠工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将稀释好的标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟。    

4.洗板3次（重要提示，一定是三次），且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.每孔加入HRP抗体结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟。    

6.洗板3次（重要提示，一定是三次），且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7. 加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8. 加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数

典型数值和参考曲线

小鼠IL-18参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为16.8ng/ml。

2.特异性：与小鼠的IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 p70, IL-13, IL-17及人IL-18等没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Lalor, S.J. et al. (2011) J. Immunol. 186:5738.

2. Gu, Y. et al. (1997) Science 275:206.

3. Fehniger, T.A. et al. (1999) J. Immunol. 162:4511.

4. Smith, D.E. (2011) J. Leukoc. Biol. 89:383.

5. Elbim, C. et al. (2005) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:436.

6. Yoshimoto, T. et al. (2000) Nat. Immunol. 1:132.

7. Kroeger, K.M. et al. (2009) J. Leukoc. Biol. 86:769.